Publicado por: otaodabiologia | 07/12/2010

Artigo traduzido da Nasa: Uma bactéria que pode crescer usando arsênio ao invés de fósforo

No dia 02/12/2010 um grupo de cientistas da Nasa divulgaram os resultados de um estudo que irá revolucionar a forma de compreender a vida. Aqui eu traduzo o texto publicado na revista Science. Peço desculpas antecipadamente pelos erros de digitação pois não tive temo de fazer uma correção. Caso encontrem algo, favor me enviar.

Todas a tabelas e imagens citadas no texto encontram-se na parte final desse artigo.

Resumo

A vida é majoritariamente composta dos elementos carbono, hidrogênio, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Embora esses seis elementos constituam ácidos nucleicos, proteínas e lipídeos e, assim, sejam a essência da matéria viva, é teoricamente possível que alguns outros elementos da tabela periódica possam servir para mesma função. Aqui nós descrevemos uma bactéria, cepa GFAJ-1 das Halomonadaceae, isolada do lago Mono Lake, Califórnia, a qual substitui o fósforo por arsênio para sustentar seu crescimento. Nossos dados indicam evidências de arsenato em macromoléculas que normalmente possuem fosfato, notavelmente ácidos nucleicos e proteínas. Alterações em um dos maiores bio-elementos podem ter profunda significância evolucionária e geoquímica.

Para ler a tradução na íntegra, faça download do arquivo pdf clicando na imagem abaixo.

Uma bactéria que pode crescer usando arsênico ao invés de fósforo

 

Resumo

 

A vida é majoritariamente composta dos elementos carbono, hidrogênio, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Embora esses seis elementos constituam ácidos nucleicos, proteínas e lipídeos e, assim, sejam a essência da matéria viva, é teoricamente possível que alguns outros elementos da tabela periódica possam servir para mesma função. Aqui nós descrevemos uma bactéria, cepa GFAJ-1 das Halomonadaceae, isolada do lago Mono Lake, Califórnia, a qual substitui arsênico por fósforo para sustentar seu crescimento. Nossos dados indicam evidências de arsenato em macromoléculas que normalmente possuem fosfato, notavelmente ácidos nucleicos e proteínas. Alterações em um dos maiores bio-elementos podem ter profunda significância evolucionário e geoquímica.

 

 

Apresentação

 

A dependência biológica dos seis maiores elementos nutrientes carbono, hidrogênio, nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo é complementada por uma matriz de outros elementos, normalmente metal(óides) presentes em quantidades ínfimas que servem para funções celulares críticas, como por exemplo cofatores enzimáticos1. Existem diversos casos em que esses elementos são substituídos por outros. Uns poucos exemplos incluem a substituição do tungstênio por molibdênio além de cádmio por zinco em algumas famílias enzimáticas2,3 e cobre por ferro como um carreador de oxigênio em alguns artrópodes e moluscos4. Nesses exemplos e em outros, os elementos que são trocados compartilham similaridades químicas que facilitam a troca. Contudo, não existem relatos de substituição para nenhum dos seis maiores elementos essenciais a vida. No presente artigo nós apresentamos evidências de que o arsênico podem substituir o fósforo em biomoléculas que ocorrem naturalmente em bactérias.

O Arsênico (As) é um análogo químico do fósforo (P), o qual se encontra diretamente abaixo de P na tabela periódica. Arsênico possui uma raio atômico similar, bem como possuir uma eletronegatividade bem próxima do P5. A forma mais comum do P em biologia é o fosfato (PO43-), o qual comporta-se de forma similar ao arsenato (AsO43-) acima da faixa de pH de interesse biológico e de gradiente redox6. A similaridade físico-química entre AsO43- e PO43- contribui para toxicidade biológica devido ao fato de que as vias metabólicas destinadas ao PO43- não conseguem distinguir as duas moléculas7 e o arsenato pode ser incorporado antecipadamente em alguns passos dessas vias6. Entretanto, pensava-se que a continuidade dos processos metabólicos eram, de forma geral, incompatíveis com moléculas que incorporaram As por causa da diferença de reatividade entre compostos de P e compostos de arsênico8. Essa continuidade das vias bioquímicas podem requerer o mais quimicamente estável metabólito baseado em P; acredita-se que o tempo de vida do mais rapidamente hidrolisado análogo do condutor de As seja muito curto. Todavia, dadas as similaridades do P e do As, e pela analogia da substituição de elementos traços, nós hipotetizamos que o AsO43- poderia substituir especificamente o PO43- em um organismo que possua mecanismos para lidar com a instabilidade dos compostos de AsO43- .6 Aqui, testamos experimentalmente esta hipótese usando AsO43- , combinando com nenhuma adição de PO43-, para selecionar e isolar um micróbio capaz de realizar essa substituição.

 

Geomicrobiologia do GFAJ-1

 

Mono Lake, localizada no leste da Califórnia, é um lago hipersalino e alcalino com altas concentrações de arsênico dissolvido (média 200 µM9). Usamos sedimentos de Lake como inóculos em um meio aeróbico artificial com pH 9,810,11contendo 10 mM de glicose, vitaminas, metais traços, mas sem nenhuma adição de PO43- nem nenhum suplemento orgânico nutricional complexo (ex. extrato de levedura, peptona) com um regime de aumento de adição de AsO43- inicialmente abrangendo o intervalo de 100 µM a 5 mM. Esses enriquecimentos foram feitos por meio de muitas transferências de diluições decimais reduzindo grandemente qualquer transporte de fósforo autóctone11. O background de PO43- no meio foi igual a 3,1 (± 0,3) µM, com ou sem adição de AsO43-, provenientes de traços de impurezas dos principais sais (tabela S1)11. A sexta transferência de 5 mM de AsO43- (sem adição de PO43-) foi monitorada de perto e demonstrou uma taxa de crescimento (µ) de 0,1 dia-1. Após diluições de 10-7, usamos um enriquecimento de 5 mM de AsO43- para inocular uma placa de ágar que continha a mesma composição química do meio artificial. Uma colônia isolada foi escolhida das placas de ágar, reintroduzida no meio líquido artificial sem adição de PO43- onde então aumentamos progressivamente a concentração de AsO43- de forma a determinar o nível ótimo de crescimento. Essa cepa isolada de GFAJ-1, que foi identificada por meio da sequência filogenética do 16S rRNA como um membro da família Halomonadaceae de Gammaproteobacteria (figura S1)11, está mantida aerobicamente com 40 mM de AsO43-, 10 mM de glicose e sem adição de PO43- (condição +As/-P). Membros dessa família demonstraram acumular As intracelular previamente12.

GFAJ-1 cresceu a um µmax médio de 0,53 dia-1 sobre +As/-P, aumentando em 20 vezes seu número de células após seis dias. Elas também cresceram mais rápido e mais extensivamente com a adição de 1,5 mM PO43- (-As/+P, µmax 0,86 dia-1). Contudo, na ausência de AsO43- e PO43- nenhum crescimento foi observado (figuras 1A e 1B). Para demonstrar o crescimento da células de forma inequívoca, usamos dois métodos independentes: densidade óptica e contagem direta de células. Células crescidas sobre +As/-P são oblongas e possuem aproximadamente 1-2 mícrons quando observadas por microscopia eletrônica (figura 1C)11. Microscopia eletrônica de transmissão revelou grandes regiões semelhantes a vacúolos em células que cresceram em meio +As/-P, o que pode contar para este aumento de tamanho (figura 1E). Estes experimentos demonstraram que o crescimento dependente de arsenato, diferenças morfológicas em GFAJ-1 causadas pelo AsO43- presente no meio de crescimento e o fato de que os níveis de impureza do PO43- no meio foram insuficientes para elicitar o crescimento no controle (-As/+P).

 

Estequiometria celular e distribuição elementar

 

De forma a determinar se GFAJ-1 absorveu AsO43- do meio, nós medimos o conteúdo intracelular de As por ICP-MS11. Em células crescidas em meio +As/-P, a média intracelular de As foi 0,19 (± 0,25) do seu peso seco (tabela 1), enquanto as células continham apenas 0,02 (± 0,01)% de P de seu peso seco. Este P foi, presumivelmente, eliminado dos traços de impurezas de PO43- nos reagentes; e não provavelmente devido ao carregamento dado por nossa estratégia de enriquecimento e isolamento. Além disso, quando as células cresciam em+As/-P o valor intracelular de P foi 30 vezes menor do que nossos valores de P medidos quando este micróbio cresceu em -As/+P e muito abaixo do 1-3% de P do peso seco necessário para suportar o crescimento em uma típica bactéria heterotrófica13. Do contrário, o crescimento celular de GFAJ-1 sobre condições -As/+P tiveram um conteúdo médio de P de cerca de 0,54 (± 9,21)% de peso seco. Houve uma variação no conteúdo total de As das células +As/-P, possivelmente um resultado da coleta durante a fase estacionária e perdas durante as centrifugações e ciclos de lavagem devido a instabilidade potencial das estruturas celulares no estado túrgido (figura 2C e 2E). Em contraste, a integridade aparentemente robusta das células -As/+P (figura 2D) e, desse modo, a medida intracelular de P dessas células reflete seu conteúdo. Contudo, o baixo total de P intracelular medido em células +As/-P estava consistentemente muito abaixo da quantidade necessária para sustentar o crescimento, sugerindo que esses valores baixos estão corretos apesar das variações dos dados das células +As/-P. O baixo conteúdo de P, em conjunto com alto conteúdo intracelular de As, foi confirmado por espectometria de massa de íons de alta resolução e por análises de raios-X, são discutidas abaixo.

Usamos um radiomarcador 73AsO43- para obter informações mais específicas sobre a distribuição intracelular do arsênico11. Observamos arsênico intracelular em frações celulares de proteínas, metabólitos, lipídeos e ácidos nucleicos (tabela 2). A fase celular estacionária incorporou aproximadamente um décimo do total de 73AsO43- em ácidos nucleicos, mas mais de três quartos do 73AsO43- em frações fenol extraídas de proteínas, com uma pequena fração em lipídeos. Nós advertimos que a grande fração proteica é, provavelmente, uma super estimativa, visto que esse passo de extração possivelmente contém numerosos pequenos metabólitos não proteináceos. De forma a determinar se a distribuição padrão reflete o suo de AsO43- no lugar de PO43- no DNA, nós estimamos que o genoma médio da bactéria é de 3,8 Mbps, o qual deve conter aproximadamente 7,5.106 átomos ou 12,5.10-18 mols de P. Assumindo um genoma completo por célula, isso deve ser igual a 0,39 fg de P no genoma. Por meio de ICP-MS, medimos cerca de 9,0 fg de P por célula em condição -As/+P, o que implica que somente ~ 4% do total intracelular de P está associado com o genoma. Uma vez que essas células são coletadas na faz estacionária11, a fração de P associada com RNA é possivelmente pequena14. Consequentemente, aproximadamente 96% do P está presumivelmente distribuído entre lipídeos e frações proteicas. Se o AsO43- está substituindo o PO43- no DNA, então podemos assumir que aproximadamente as mesma fração do total intracelular de AsO43- deverá refletir uma distribuição similar a nossa distribuição estimada de PO43-. A distribuição intracelular de 73AsO43- em nossos experimentos foi consistente com essas estimativas. Se o 73AsO43- está cumprindo o papel biológico do PO43-, então o AsO43- poderia atuar em muitos papéis bioquímicos análogos, incluindo DNA, fosforilação de proteínas metabólitos de pequeno peso molecular (ex. Análogos arsenilados de NADH, ATP e intermediários como glicose e acetil-CoA) e fosfolipídeos.

Nossos dados sugerem que o arsênico estava presente em vários biomoléculas e em particular procuramos confirmar a presença de arsênico no DNA. Inicialmente, medimos traços de As por análise de ICP-MS do extrato de ácido nucleico e de proteínas/metabólitos de células crescidas em +As/-P (tabela S1)11. Nós então utilizamos uma espectometro de massa de íons de alta resolução (NanoSIMS) para identificar positivamente o As no extrato (figura 2A). Estes dados mostram que o DNA derivado de células +As/-P tinham um conteúdo elevado de As e baixo de relativo ao DNA de células -As/+P. Analises NanoSIMS do DNA mostrou que a razão As:P em um átomo por átomos base foi significativamente maior em células +As/-P versus -As/+P (figura 2A, tabela S2)11. Tanto expressado como uma razão entre íons relativa ao C (75As:12C, figura 2A) ou 31P:12C (tabela S2)11 ou normalizado pela produção relativa de íons e expressado como uma concentração em partes por bilhão (tabela S2)11, percebemos uma tendência consistente de similaridade, com significativamente mais As em DNA +As/P-, e maior P em DNA -As/+P. Em ambos os casos os elementos não alterados foram iguais ou menores que os níveis do background. Estas medidas, portanto, demonstram especificamente que o extrato de DNA purificado de células +As/-P continham As. Nossas análise nanoSIMS, combinadas com evidências de arsênico intracelular por ICP-MS e nosso experimento usando radiomarcador 73AsO43- demonstraram que o AsO43- intracelular foi incorporado a biomoléculas chave, especificamente DNA.

 

Caracterização do meio químico do arsênico intracelular

 

Usamos estudos de raio-X síncotron para determinar a especificação e o meio químico do arsênico intracelular11. Micro absorção de raios-X próximos da banda de espectroscopia (µXANES) de células +As/-P exibiram uma banda de absorção de As(V) coordenada sem evidẽncias de As(III) observado. Os melhores ajustes do espectro estendido de micro absorção de raios-X de fina estrutura (µEXAFS) estão listados na tabela 3 e mostrados na figura 3. A primeira região vizinha ao redor do arsênico em células +As/-P consiste de quatro ligantes do oxigênio (tabela 3), mas possui uma segunda região que é inconsistente com nossos modelos As-Fe e As-S, íons de arsenato livre ou espectros organo-arsênicos já publicados (figura 3A)15,16. Enquanto outros compostos de arsênico, como o dimetillarsinato (DMA), também possuem ligações As-O e As-C, eles possuem posições de borda que são deslocadas para energias abaixo do observado As(V) e tem distâncias de ligações As-C muito menores16. Em contraste aos nossos modelos, estas distâncias As-O e As-C são consistentes com o que foi relatado a partir da estrutura cristalina do DNA para a posição análoga do P relativo aos átomos de O e C (figura 3A)16,17. Portanto, nossos dados obtidos por raios-X dão embasamento a posição do arsenato em uma configuração similar a do fosfato no esqueleto de DNA ou bem como potencialmente a outras moléculas. Estes dados também indicam evidências para a presença de arsenato em metabólitos de baixo peso molecular (ex. Análogos arsenilados de NADH, ATP e intermediários como glicose e acetil-CoA), bem como proteínas arsenilatadas em que o arsenato substituiria o fosfato em resíduos de serina, tirosina e treonina (tabela S3)1,11. Dados de fluorescência de micro raios-X (µXRF) confirmaram nossas medidas de ICP-MS e mostraram um pequeno background de P que contrasta com regiões de alto conteúdo de arsênico correlacionado com altos conteúdos de ferro e zinco (figura 3B, figura S2)11. Estes dois últimos elementos são rotineiramente usados como representantes para presença de material celular (como C, N e O) em nossos experimentos devido ao fato de que a luz desses elementos não pode ser detectada por fluorescência de raios-X sobre nossas condição de ausência de vácuo. Entretanto, para dar suporte a distribuição de arsênico com material celular, nós usamos NanoSIMS para mapear taxas iônicas celulares de 75As:12C e 31P:12C (figura 2B-G, figura S2)11. Essas análises confirmam, com uma resolução muito mais precisa, a distribuição intracelular de As com C na condição +As/-P com um baixo background de P (figuras 2B, 2D, 2F). Isto está em contraste a distribuição intracelular de P em células que cresceram em condições -As/+P (figuras 2C, 2E, 2G). Pelo fato de que os dados da absorção de raios-X forneceram informações a respeito da coordenação média do arsênico, nossos dados identificaram uma mistura de componentes nas células. Esses resultados indicam que esses componentes são dominados pelas estruturas coordenadas arsênico(V)-oxigênio-carbono e, assim, o meio das ligações que descrevemos é consistente com nossos dados NanoSIMS (figura 2A) e podem ser atribuídos ao DNA. Em resumo, estes dados mostram que o arsênico está no estado redutor +5 e ligado ao O e distal aos átomos de C com comprimentos de ligação covalente aceitáveis identificando o arsenato assimilado em biomoléculas dentro das células em especificamente coordenação relevante.

Nossos dados mostram o crescimentos arsênico-dependente de GFAJ-1 (figura 1). O crescimento foi acompanhado pela tomada de arsenato e assimilação em biomoléculas incluindo ácidos nucleicos, proteínas e metabólitos (tabela 1 e 2, figuras 2 e 3). Em alguns organismos, o arsênico induz genes específicos de resistência para fazer frente a sua toxicidade7; enquanto alguns micróbios dissimiladores utilizadores de arsênico podem conservar energia para o crescimento a partir da oxidação de espécies reduzidas de arsênico, ou “respirar” AsO43-, como um aceptor terminal de elétrons. Nosso estudo é diferente pois nós usamos arsênico como um agente seletivo e excluímos o fósforo, até agora o maior de todos os requerimentos em todos os organismos conhecidos. Todavia, GFAJ-1 não é um arsenófilo obrigatório e cresce consideravelmente melhor quando disponibilizado de P (figura 1A, 1B). Embora esters de AsO43- são previstos ser em ordens de magnitude menos estáveis que os esters de PO43-, pelo menos para moléculas simples8, GFAJ-1 pode enfrentar essa instabilidade. As regiões semelhantes a vacúolos observadas em células GFAJ-1 quando crescem em condições +As/-P são potencialmente ricas em poli-β-hidroxibutirato [como mostrado em outras espécies de Halomonas]19, as quais podem estabilizar estruturas do tipo As(V)-O-C por que ambientes não aquosos parecem promover taxas de hidrólise mais lentas para os compostos relatados8. Propomos que regiões intracelulares ou mecanismos que excluem água podem também promover esta estabilidade.

Nós reportamos a descoberta de um micróbio incomum, cepa GFAJ-a, que excepcionalmente pode variar a composição elementar de suas biomoléculas por meio da substituição do P por As. Como o arsênico se insinua na estrutura das biomoléculas pe ainda incerto, e os mecanismos pelos quais essas moléculas operam são desconhecidos.

 

Referências

 

1. J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer, Biochemistry . (WH Freeman & Co, New York, ed. 6th, 2007).

2. R. Hille, Trends Biochem Sci 27 , 360 (2002).

3. T. Lane, F. Morel, Proc Natl Acad Sci U S A 97 , 4627 (2000).

4. G. Jameson, J. Ibers, in Biological Inorganic Chemistry: Structure and Reactivity, I. Bertini, H. Gray, I. Stiefel, J. Valentine, Eds. (University Science Books, Sausalito,2007), pp. 354.

5. D. Lide, Ed., CRC Handbook of Chemistry and Physics, 90th Edition (Internet Version 2010) ,(CRC Press/Taylor and Francis, Boca Raton, 2010).

6. F. Wolfe-Simon, P. C. W. Davies, A. D. Anbar, Int J Astrobio 8 , 69 (2009).

7. B. Rosen, FEBS Lett 529 , 86 (2002).

8. C. D. Baer, J. O. Edwards, P. H. Rieger, Inorg. Chem. 20 , 905 (1981).

9. R. Oremland, J. F. Stolz, J. T. Hollibaugh, FEMS Microbiol Ecol 48 , 15 (2004).

10. J. Switzer Blum, A. Burns Bindi, J. Buzzelli, J. Stolz, R. Oremland, Arch Microbiol 171 , 19 (1998).

11. Materials and methods are available as supporting material on Science Online.

12. M. Takeuchi et al. , J Biotechnol 127 , 434 (2007).

13. W. Makino, J. Cotner, R. Sterner, J. Elser, Funct Ecol 17 , 121 (2003).

14. J. Mandelstam, Bactierol Rev. 24 , 289 (1960).

15. P. Smith et al. , Environ. Sci. Technol 39 , 248 (2005).

16. I. Pickering et al. , Plant Physiol. 122 , 1171 (2000).

17. S. Holbrook, R. Dickerson, S. H. Kim, Acta Cryst B41 , 255 (1985).

18. R. S. Oremland, J. F. Stolz, Science 300 , 939 (2003).

19. J. Quillaguaman, O. Delgado, B. Mattiasson, R. Hatti-Kaul, Enzyme Microb Technol 38 , 148 (2006).

 

 

 

 

Anúncios

Deixe um comentário

Preencha os seus dados abaixo ou clique em um ícone para log in:

Logotipo do WordPress.com

Você está comentando utilizando sua conta WordPress.com. Sair / Alterar )

Imagem do Twitter

Você está comentando utilizando sua conta Twitter. Sair / Alterar )

Foto do Facebook

Você está comentando utilizando sua conta Facebook. Sair / Alterar )

Foto do Google+

Você está comentando utilizando sua conta Google+. Sair / Alterar )

Conectando a %s

Categorias

%d blogueiros gostam disto: